Mitochondrialny kanał potasowy typu BKCa o dużym przewodnictwie aktywowany jonami wapnia – budowa i interakcje : praca doktorska

Gałecka, Shur Karolina

Skip to main menu
Skip to search engine
Skip to content
Skip to footer

Mitochondrialny kanał potasowy typu BKCa o dużym przewodnictwie aktywowany jonami wapnia – budowa i interakcje : praca doktorska

Download

Description
Information

Title: Mitochondrialny kanał potasowy typu BKCa o dużym przewodnictwie aktywowany jonami wapnia – budowa i interakcje : praca doktorska

Abstract:

Mitochondrialne kanały potasowe, zlokalizowane w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji mitochondriów. Kanały te, obecne w różnych tkankach, takich jak serce, mózg czy mięśnie szkieletowe, kontrolują napływ jonów potasu do macierzy mitochondrialnej, co wpływa na objętość mitochondriów, depolaryzację ich wewnętrznej błony oraz szybkość zużycia tlenu i syntezę reaktywnych form tlenu. Ich aktywacja chroni komórki przed uszkodzeniami wywołanymi niedokrwieniem i reperfuzją oraz reguluje metabolizm komórek nowotworowych. Głównym obiektem badawczym w niniejszej pracy był mitochondrialny kanał potasowy o dużym przewodnictwie aktywowanych jonami wapnia, tzw. kanał mitoBKCa. Aktywacja tego kanału zwiększa przeżywalność komórek w czasie niedokrwienia-reperfuzji komórek serca czy mózgu. Podstawowe właściwości biofizyczne i farmakologiczne kanału mitoBKCa odpowiadają właściwościom kanałów BKCa z błony plazmatycznej. Kanał ten tworzą podjednostki oraz regulatorowe podjednostki typu. W pierwszej części pracy zweryfikowano hipotezę mówiącą, że izoforma VEDEC podjednostki może tworzyć kanał mitoBKCa. Izoforma ta, będąca produktem alternatywnego składania produktu genu KCNMA1, kodującego błonowe kanały BKCa, jest kierowana do mitochondriów. Jednakże brak było bezpośrednich dowodów, że białko to tworzy funkcjonalny kanał w mitochondriach. W pracy wykorzystano komórki HEK293T do ekspresji wariantu VEDEC, a następnie wykorzystując techniki patch-clamp mitoplastów rejestrowano aktywność kanału w mitochondriach. Po raz pierwszy stwierdzono, że przejściowa ekspresja izoformy VEDEC prowadzi do aktywności kanału o przewodnictwie 290 ± 3 pS. Kanał był zależny od napięcia i aktywowany przez jony wapnia. Aktywność kanału była aktywowana przez NS11021 i hamowana przez heminę oraz paksylinę, które są znanymi modulatorami kanałów BKCa. Eksperymenty immunofluorescencyjne potwierdziły częściową kolokalizację kanału z mitochondriami. Uzyskane dane potwierdziły, że izoforma VEDEC kanału BKCa tworzy funkcjonalny kanał w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Dodatkowo, wykonane doświadczenia pokazały, że komórki HEK293T są obiecującym modelem doświadczalnym do badań mitochondrialnych kanałów potasowych. W drugiej części pracy podjęto próbę identyfikacji nowych partnerów białkowych podjednostki regulatorowej 4 kanału BKCa. W związku z tym zastosowano biotynylację partnerów białkowych z wykorzystaniem ligazy TurboID sfuzjowanej z podjednostką regulatorową 4 kanału BKCa. Identyfikacja białek biotynylowanych z wykorzystaniem spektrometrii mas ujawniła grupę białek będących potencjalnymi partnerami kanałów typu BKCa. Jednym z białek oddziałujących z kanałem BKCa okazało się białko TMX1 zlokalizowane we frakcjach błonowych łączących mitochondria oraz siateczkę śródplazmatyczną. Przeprowadzone badania wykorzystujące koimmunoprecypitację badanych białek oraz analizę Western blot wykazały oddziaływania tego białka nie tylko z podjednostką 4, ale też z izoformą VEDEC podjednostki tworzącą por kanału.